?北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院教授、核糖核酸北京研究中心研究員汪陽明團(tuán)隊(duì)在Nature Methods在線發(fā)表題為“Co-profiling of in situ RNA-protein interactions and transcriptome in single cells and tissues”的研究論文，報(bào)道了團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的新一代RNA結(jié)合蛋白（RBP）研究技術(shù)——MAPIT-seq（Modification Added to RBP Interacting Transcript sequencing）。該方法克服了目前RBP-RNA互作技術(shù)在實(shí)驗(yàn)流程、適用樣本和檢測分辨率上的局限性，能夠應(yīng)用于微量細(xì)胞以及原代組織，兼容高通量單細(xì)胞與長讀長測序平臺(tái)，并允許RNA-蛋白互作與轉(zhuǎn)錄組同時(shí)檢測，為深入解析RBP調(diào)控機(jī)制提供了通用、靈敏和高分辨率的研究工具。
RBP是調(diào)控RNA命運(yùn)與功能的核心因子，廣泛參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：剪接、穩(wěn)定性調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯控制等多個(gè)生物學(xué)過程，在干細(xì)胞命運(yùn)決定、神經(jīng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用1。深入理解RBP調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不僅對(duì)基礎(chǔ)生物學(xué)意義重大，也為靶向治療提供潛在策略。然而，精確解析快速動(dòng)態(tài)變化的RBP與RNA的結(jié)合及其功能效應(yīng)，仍面臨著諸多關(guān)鍵技術(shù)障礙。傳統(tǒng)方法如CLIP-seq對(duì)樣本要求起始量大，依賴紫外交聯(lián)，流程復(fù)雜2；而其他前沿方法則面臨如通量低、依賴基因改造、無法同時(shí)獲取轉(zhuǎn)錄組信息、缺乏時(shí)間/單細(xì)胞/異構(gòu)體分辨率等限制，難以廣泛應(yīng)用于組織樣本或臨床材料相關(guān)的復(fù)雜研究中3—5。
針對(duì)上述挑戰(zhàn)，汪陽明團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)并開發(fā)了MAPIT-seq技術(shù)。該方法通過“抗體定位+RNA編輯”的策略，將體外純化的protein A/G與兩種RNA編輯酶ADAR和APOBEC1的融合蛋白通過特異性抗體招募至目標(biāo)RBP結(jié)合的RNA區(qū)域，原位編輯三小時(shí)在RBP結(jié)合位點(diǎn)附近產(chǎn)生高效且特異的堿基編輯信號(hào)，繼而通過高通量測序精準(zhǔn)識(shí)別RBP-RNA互作事件（圖1）。該方法不依賴基因工程操作，適用于固定細(xì)胞和冷凍組織，具有通用性強(qiáng)、分辨率高、操作簡便等特點(diǎn)。更重要的是，MAPIT-seq在檢測互作圖譜的同時(shí)可以同步獲取轉(zhuǎn)錄組信息，實(shí)現(xiàn)功能結(jié)合與表達(dá)背景的雙重解析。
圖1MAPIT-seq方法原理圖
該研究展示了MAPIT-seq在多種實(shí)驗(yàn)場景中的應(yīng)用。研究人員在模型細(xì)胞中展示了MAPIT-seq僅需普通RNA-seq的測序深度即可高效捕獲內(nèi)源RBP互作，驗(yàn)證了其揭示YTHDF2、RBFOX2、PTBP1和PUM1等典型RBP靶標(biāo)、結(jié)合基序與功能模式的可靠性；在小鼠胚胎與胚胎腦組織切片中，MAPIT-seq成功捕獲了G3BP1的發(fā)育期結(jié)合圖譜，揭示其在神經(jīng)系統(tǒng)中的潛在功能；經(jīng)過測試，MAPIT-seq可以滿足500個(gè)細(xì)胞為起始的RBP結(jié)合解析。通過與10X高通量單細(xì)胞測序平臺(tái)結(jié)合，MAPIT-seq進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞水平同時(shí)獲取RBP結(jié)合圖譜和細(xì)胞狀態(tài)信息，揭示了不同細(xì)胞周期階段中RBP結(jié)合靶標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化。此外，通過結(jié)合長讀長測序，MAPIT-seq還實(shí)現(xiàn)了對(duì)RNA異構(gòu)體上的結(jié)合特異性解析，為理解RBP如何調(diào)控特定RNA異構(gòu)體提供了有力工具。
MAPIT-seq為RBP研究提供了一個(gè)強(qiáng)大的“工具箱”，與不同樣本或測序平臺(tái)結(jié)合可以形成三種版本（圖2）。其非依賴遺傳操作的設(shè)計(jì)為原代組織與臨床樣本研究提供了可行路徑，單細(xì)胞與轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體水平的分辨率亦拓展了RBP調(diào)控研究的深度與廣度，而雙組學(xué)同時(shí)分析的能力更為解析RBP結(jié)合的分子層面的功能提供了支撐。未來，團(tuán)隊(duì)計(jì)劃將該方法與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)融合，拓展編輯酶工具箱和分析流程，進(jìn)一步提升其空間和堿基精度，精準(zhǔn)繪制組織器官內(nèi)RBP調(diào)控圖譜，并推動(dòng)MAPIT-seq在疾病研究、藥物靶點(diǎn)識(shí)別及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
圖2 MAPIT-seq方法的特征與應(yīng)用
北京大學(xué)未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所博士生程玘軒和前沿交叉學(xué)科研究院PTN項(xiàng)目博士生謝崗為論文的共同第一作者，汪陽明為通訊作者。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張翔宇、肖俊宇教授為論文作出了重要貢獻(xiàn)，前沿交叉學(xué)科研究院王杰，未來技術(shù)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)研究所丁雙進(jìn)、吳怡霞、石銘、段菲菲、萬子力，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院韋競嘉也為論文工作作出了貢獻(xiàn)。本研究獲得了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和自然科學(xué)基金的資助支持。
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