?子科生物報道:逆轉座子是一類可以通過“復制-粘貼”的方式在基因組上發(fā)生跳躍的DNA元件。R2是低等真核生物中廣泛存在的一種逆轉座子。它們專一性地“寄生”在宿主基因組的28S核糖體DNA中，借助宿主基因的啟動子，合成自身的mRNA和蛋白質并組裝形成R2復合物（“復制”過程）；R2復合物可再次識別宿主28S核糖體DNA上的專一性位點，通過核酸酶（endonuclease, EN）結構域切開DNA雙鏈，再通過逆轉錄酶（reverse transcriptase, RT）結構域逆轉錄合成cDNA，將R2基因序列重新整合到宿主基因組上（“粘貼”過程），完成“增殖”。

有趣的是，逆轉座子等可移動的DNA元件在基因組上跳躍的過程中，極大地豐富了基因組的組成，被認為在基因組進化的過程中扮演著重要的作用。因此，理解逆轉座子在基因組上跳躍的分子機制將有助于思考“我們的基因組從哪里來、如何來”的問題。此外，利用逆轉座子在基因組上跳躍的性質，開發(fā)新的核酸操縱工具，將具有巨大的應用前景（Science， 2023）。

圖1. 逆轉座子通過“復制-粘貼”在基因組上跳躍的示意圖

2023年6月9日，劉俊杰課題組在《細胞》（Cell）雜志在線發(fā)表了題為“R2逆轉座子中結構性RNA組分監(jiān)督順序性DNA切割”（Structural RNA components supervise the sequential DNA cleavage in R2 retrotransposon）的研究論文。報道了R2逆轉座子的mRNA中存在兩段結構性的RNA，共同調控DNA雙鏈的順序性切割，從而保證逆轉座的準確進行。此外，課題組還將第二類內含子（Group II intron）、LINE-1逆轉座子與R2逆轉座子進行了比較，總結了生物大分子進化過程中，以RNA為主導逐漸過渡到以蛋白質為主導的進化趨勢，提出了新穎的見解。

課題組發(fā)現(xiàn), 位于R2 mRNA 3’端非翻譯區(qū)的RNA（3’-RNA）在R2蛋白質切割DNA雙鏈的過程中，表現(xiàn)出促進第一條鏈切割、抑制第二條鏈切割的作用；位于5’端翻譯區(qū)的RNA（5’-RNA）則表現(xiàn)出降低第一條鏈切割、激活第二條鏈切割的作用；而當5’-RNA與3’-RNA同時存在時，總是表現(xiàn)出3’-RNA的調控作用，并且完全抑制第二條鏈的切割。為了進一步理解其中的分子機制，課題組解析了R2逆轉座子在3’-RNA結合狀態(tài)和5’-RNA結合狀態(tài)的高分辨結構。在3’-RNA結合狀態(tài)中，DNA底物被蛋白質特異性識別，3’-RNA核心區(qū)域結合在蛋白質的RNA結合（RNA binding, RB）結構域上。在5’-RNA結合狀態(tài)中，5’-RNA呈現(xiàn)出復雜的“三爪（three-claw）”結構，緊密的包裹住蛋白質核心。值得注意的是，5’-RNA的其中一個爪（Claw3）同樣結合在RB結構域上，且生化分析表明，Claw3對激活第二條鏈切割是必要的。

圖2. 3’-RNA結合狀態(tài)（左）和5’-RNA結合狀態(tài)（右）的復合物結構

此外，課題組用一段連接序列將5’-RNA與3’-RNA連接成一條RNA，設計了R2全長mRNA的模擬物（L-RNA），并獲得了R2逆轉座子在L-RNA結合狀態(tài)的結構。在這個結構中，5’-RNA同樣以“三爪”的形式與蛋白質核心緊密結合，但由于3’-RNA的擠占，起激活第二條鏈切割作用的Claw3未能與RB結構域結合。課題組發(fā)現(xiàn)，L-RNA中3’-RNA與蛋白質RB結構域的結合將抑制第二條鏈的切割，但當提供dNTP作為原料，使逆轉錄可以發(fā)生后，3’-RNA在作為逆轉錄模板的過程中逐漸從RB結構域上解離下來，5’-RNA得以與RB結構域結合，從而激活第二條鏈的切割。

圖3. L-RNA結合狀態(tài)的復合物結構與RNA監(jiān)督DNA雙鏈順序性切割的示意圖

綜合以上分析，課題組總結得出了R2逆轉座子在基因組上跳躍的分子機制：R2蛋白質特異性識別28S核糖體DNA序列后，蛋白質RB結構域首先結合R2 mRNA上的3’-RNA，促進第一條DNA鏈的切割，同時抑制第二條鏈的切割，僅暴露出第一條鏈的3’-OH作為引物，從mRNA的3’端起始逆轉錄過程（Target-primed reverse transcription, TPRT），隨著逆轉錄的進行，位于mRNA 3’端的3’-RNA逐漸從蛋白質RB結構域解離，對第二條鏈切割的抑制作用得以釋放，R2 mRNA上的5’-RNA與RB結構域的結合進一步激活了第二條鏈的切割。由此，位于mRNA兩端的結構性RNA共同監(jiān)督了DNA雙鏈的順序性切割。這種嚴密的順序性切割保障了依賴宿主基因表達元件的R2逆轉座子進行“有效的增殖”，從而在28S核糖體DNA中不斷產生有活性的拷貝。

圖4. R2逆轉座子在基因組上發(fā)生跳躍的分子機制與意義

有趣的是，課題組將低等真核生物的R2逆轉座子與其祖先（原核生物第二類內含子，Group II intron）和哺乳動物中的LINE-1逆轉座子進行了比較，發(fā)現(xiàn)在Group II intron向R2逆轉座子及進一步向LINE-1逆轉座子進化的過程中，RNA的結構性組分逐漸減少并被編碼區(qū)域所取代，并且催化功能逐漸從以RNA為主導過渡到以蛋白質為主導，為理解生物大分子進化提供了新的視角。此外，LINE-1逆轉座子在哺乳動物基因組中廣泛存在且具有逆轉座活性，為基因組提供進化驅動力的同時，也為基因組穩(wěn)定性和基因表達帶來了重大的影響。對R2逆轉座子在基因組上跳躍的分子機制的研究，將啟發(fā)我們思考LINE-1逆轉座子這類“自私的基因”與基因組之間精彩的博弈過程。

圖5.逆轉座子中RNA與蛋白質共進化趨勢的示意圖

清華大學生命學院劉俊杰助理教授和副研究員王家為本文共同通訊作者；高精尖結構中心卓越學者鄧譜涓博士和清華大學生命學院2021級博士生譚順青為本文共同第一作者；清華大學生命學院本科生楊啟羽，2020級博士生朱漢舟，中國科學院動物研究所王皓毅研究員及博士生傅良政、吳亞超，清華大學生命學院張強鋒副教授及已出站博士后孫磊（現(xiàn)山東大學生命科學學院研究員），清華大學生命學院吝易助理教授及博士生包章彬均參與了本文研究。美國Broad研究所張鋒教授和Max E. Wilkinson博士在原子模型搭建中提供了寶貴的建議。清華大學冷凍電鏡平臺為本研究提供了設備和技術支持。本研究得到了中華人民共和國農業(yè)農村部、科技部2030-“腦科學與類腦研究”重大項目、國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、劉俊杰實驗室啟動經(jīng)費、中國博士后科學基金和中國科學院戰(zhàn)略先導專項的支持。